摘要:在质量指南Q8和最近的皮肤外用制剂的质量和等效性指南草案中，对产品和工艺理解的要求越来越高，揭示了流变学方法作为外用半固体剂型微结构表征工具的巨大潜力。因此，程序标准化是迫切需要。这项工作旨在开发和验证流变学分析的方法指南。用1%氢化可的松乳膏作为模型乳膏制剂。通过风险评估分析，对所选关键方法变量(几何形状、温度和应用模式)的影响进行了广泛的流变关键属性评估，包括零剪切黏度、上剪切稀化黏度、下剪切稀化黏度、无限剪切黏度、旋转屈服点、触变相对面积、线性黏弹性区域、振荡屈服点、储能模量、损耗模量和损耗角正切。该方法的拟议验证包括流变仪鉴定，随后是关于流变特征采集的众多操作关键参数的验证。触变相对面积、振荡屈服点、流动点和黏度相关的终点被证明是高度敏感和有区别的参数。这一基本原则为开发可靠和稳健的流变特征采集提供了标准框架。

关键词:流变学；方法验证；设备验证；外用制剂；监管要求

1.     引言

  外用半固体剂型包括复杂的多相系统，需要详细的流变学表征，因为这些特性可能会显著影响质量和性能[1，2]。流变学是研究材料的流动和变形行为，可以通过对样品施加外力(剪切诱发变形)来测量[3]。与配方黏度、弹性和塑性相关，流变行为可能会影响产品制造、外观、包装、长期稳定性、分散、感官特性和体内性能[4，5]。因此，流变评估被证明是一种有用的质量和稳定性指标，揭示了有关批次稳定性、产品美学特性、治疗效果和患者依从性的预测信息[2，6，7]。加强对流变参数的理解和控制是新药或仿制药申请的可持续发展的基础，满足利益相关者的期望[8]。

外用半固体剂型主要表现出非牛顿行为，因为较高的剪切速率会导致黏度降低，这使得在皮肤上使用变得更容易[9]。因此，配方开始流动需要一定的临界应力值(屈服应力)。小于这个数值，产品主要呈现弹性；相反，大于该数值，材料主要显示塑性流动[10]。

类似地，有许多流变学属性直接影响外用产品的微观结构，从而影响药物的很多个方面。例如，制剂在皮肤上的铺展性和生物黏附性受黏弹性的影响很大。当患者直接在皮肤上涂抹外用制剂，这些感官属性对于确保患者的可接受性以及治疗依从性至关重要[10–13]。

稳定性和物理外观也取决于流变特性。详尽的流变特性为产品在货架期内沉淀或分离的原因提供了有价值的分析。此外，该方法可以确定无论任何时候，采取包装软管给药还是计量泵[10]给药，是否会对产品的微观结构有显著影响。还可以反映生物制药特性，例如药物释放和渗透也依赖于配方的流变特性[13，14]。鉴于上述所有原因，流变行为是半固体制剂目标药物质量概况的关键质量属性[5，10，15]。

流变特性高度依赖于关键药物原料(CMAs)和关键工艺参数(CPPs)，因此，密切的流变监控可以成为指导和缩短产品开发、确保产品质量和减少制造过程中批次差异的有用工具[7]。这符合制药行业日益增长的对工艺的理解和提高产品质量的需求。这也是质量源于设计(QbD)的基本原则。这种新的制药监管概念是以一种系统的、基于风险的方法为基础提出的，通过对原材料和工艺参数的详细了解来调整所需的产品质量状况[11，16，17]。

QbD方法首先涉及目标药物质量概况(QTPP)和关键质量属性(CQAs)的定义，其中流变特性应是首要关注的问题。之后，通过详细的风险分析，应该清楚的识别关键材料属性和关键工艺参数。建立好这些参数后，应进行实验设计(Does ),以便最终建立设计区间和可行的控制策略[11，16，17]。最后一步是最重要的，因为这一步确保这一过程是可控的，而且保持在确定的设计区间内[18]。利用了过程分析技术(PAT)的制造过程中的测量可以整合为控制策略的一部分。尽管过程分析技术越来越多地应用于固体剂型，但其在半固体制剂中的应用还不是一种常见的解决方案[19]。一些作者已经探索了流变学作为过程分析技术工具的潜力。

Qwist等人开发了一种压差装置，可从大量中间产品/产品流中取样，并通过频率扫描确定储能模量(G′)和损耗模量(G″)，以及测试流动曲线[ 19]。此外，Van Heugten及其同事评估了灌装温度对软膏屈服应力的影响。基于这一知识，作者能够建立一个最佳的灌装黏度范围，这反过来又能够保证罐装时最小的重量变化，以及最终产品期望的屈服应力[20]。

一旦控制策略的可变性被深刻理解，如果遵循QbD原则，一个更加灵活的监管批准就可以得以实现。作为控制策略的一部分，通过降低产品批间差和提高产品稳定性，流变学作为过程分析技术工具，有助于提升药物配方和制造能力[11，16]。

正如外用制剂质量和一致性评价的草案指南中强调的那样，在开发一款药物产品的时候，以病患为中心的要求应当加以重视。因此，正如前面提到的，以下几个方面，例如高度依赖于流变学特性的患者可接受度，在开发药物的时候需要首先考虑。这对新药产品是有效的，同时对处理仿制药物也具有重要意义的。

作为临床终点研究的替代方案的EMA指南草案，是一个外用仿制药等效性评价的标准框架。因此，为了药物的申请，拓展了的药物等效性标准必须得以满足。（i） 定性、定量和微观结构与参照样品的一致性（分别为Q1、Q2、Q3）；（ii）产品体外释放的性能测试（Q4），以及最终的，（iii）如果测试样品被认定是复杂的制剂，等效性验证应当通过体外皮肤透过或者皮肤动力学研究进行验证。

在这种情况下，微观结构等效性验证是外用仿制药生物等效性评估的最重要部分。

经文献广泛描述的多种因素，影响药物产品的微观结构，这其中流变学特性具有无可辩驳的作用。因此，EMA提出了描述给定药物制剂流变学行为的流变学参数。这些参数包括：（i） 完整的剪切流动曲线：应力（或粘度）与剪切速率的关系；（ii）屈服点值；（iii）线性粘弹性响应，（iv）储存模量和损耗模量与频率/应力的关系；和（v）触变相对面积。尽管FDA需要提供流变终点，与EMA相比，该列表并不详尽。

然而，尽管存在一些关于流变学适用性和整体重要性的文献报告，但对这一技术的正式验证程序缺乏理解和标准化。迄今为止，文献中既没有定义半固体制剂流变特性的参数，也没有定义它们的接受极限。此外，在放行新批次时，重要的流变参数不包括在常规分析中[6]。在这种情况下，应提供适用于所有半固体剂型的广泛验证，确保开发的流变学测量方法具有适当的鉴别能力，以确定制剂的“一致性”，并检测可能影响临床表现的制剂差异[26]。此外，还应提供详尽的具有强制性质量参数的流变学特征。

为了实现流变方法的标准化，无论是用于辅助质量控制还是潜在的过程分析技术工具，我们对可能影响流变特性的流变操作参数进行了全面表征。为此，分析质量源于设计(aQbD)的假设，包括用于对关键方法变量(CMV)对关键分析属性(CAA)的影响进行排序的风险评估，被认为是对流变仪的操作范围、实验设置和流变测量方法进行系统验证，以获得合适的流变学特征。

考虑到常规分析验证的所有相关因素，包括测试精度、区分·能力和可靠性，进行了特定的旋转和振荡测量以及数据分析[27]。1%（w/w）氢化可的松乳膏被用作模型产品。指南草案中指出的关于外用产品的质量和等效性的其他建议也同样得到了处理[21]。

2.         材料和方法

2.1.材料

微粉化氢化可的松乳膏由Laboratórios Basi Indústria Farmacêutica S.A.友情提供。（Mortágua，葡萄牙）。对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯分别是购自阿尔法埃莎（德国坎德尔）。Kolliwax GMS II（甘油单硬脂酸酯），KolliwaxCA（鲸蜡醇）、Kollicream IPM（肉豆蔻酸异丙酯）和 Dexpanthenol Ph. Eur. 由巴斯夫欧洲公司（德国路德维希港）友情提供。硬脂酸由Acorfarmadistribuicion S.A提供.（西班牙马德里）。三乙醇胺购自 Panreac AppliChem（德国达姆施塔特）。液体石蜡由LabChem Inc.（美国宾夕法尼亚州Zelienople）提供。甘油购自VWR Chemicals（比利时鲁汶）。水被净化（Millipore）并在使用前通过0.22毫米的尼龙过滤器过滤。黏度参考标准液RT5000（Fungilab，Spain）用于流变仪鉴定研究。

1. 2.2 方法

2. 2.2.1 氢化可的松乳膏的制备

氢化可的松乳膏 o/w乳膏制剂通常借助于Ultra-Turrax X 10/25 (Ystral GmbH，Dottingen，德国)设备制备。连续相和分散相分别制备，并加热至70°C[11，28]。之后，活性药物成分溶解在分散相中。先前的研究建立了与制造过程的速率、持续时间和温度相关的最佳实验设置。生产后，将乳膏制剂冷却至室温。每批次制备0.5千克。所有样品都储存在20–25°c下

为了证明流变仪器的鉴别能力，考虑到单硬脂酸甘油酯的不同浓度，制备了三种配方: 5% (F5)，10% (F10)和20% (F20)。由于其增稠特性，这种赋形剂对产品微观结构具有重大影响[11，28]。请注意，F10被视为参考配方。此外，用10%的单硬脂酸甘油酯制备第四种制剂，但是考虑到制造过程中不同的均化速率。该配方将作为F10阴性对照(F10NC)进一步处理。

1. 2.2.2流变特性

使用HAAKE MARS 60 (赛默飞，Karlsruhe，德国)研究了所有产品的流变特性，该仪器配备有作为温度控制单元的半导体系统。使用Haake RheoWin数据管理软件(德国卡尔斯鲁厄，Thermo Scientific)评估数据。对于每次分析，样品罩用于最大限度的减少温度波动。

考虑到EMA最近发布的关于局部产品质量和等效性的指南草案，完整的流变特性应包括旋转和振荡测量[21]。

旋转测试是样品破坏性的。从这些测量中检索的信息使得能够评估影响结构破坏和/或重新排列的小的周期性变形。此外，通过这些测试，还可以研究材料的恢复能力。

关于振幅和频率扫描测试的振荡测试。一般来说，由于所施加的剪切应力减小，这些测量可以被认为是非破坏性的，然而，应该指出的是，在振幅扫描测试过程中，仍然会出现较小的系统扰动。振荡测量旨在评估材料的黏弹性，同时伴随着小振幅变形力[28]。以下各节详细介绍了这两种方法的主要成果。

旋转测量

使用C35/2 /Ti锥形转子在32℃下进行旋转试验。使用正位移注射器将大约0.3克制剂置于TMP35的下板上。设置0.1毫米的预设间隙。

从0.01到250 Pa的线性CS阶跃测试，时间800 s，以描绘流动曲线[ƞ = f(τ)]。为了表征流动行为，检测接下来的响应或关键分析属性(CAA):零剪切黏度(ƞ0)、高剪切稀化黏度(ƞU)、低剪切稀化黏度(ƞL)、无限剪切黏度(ƞ∞)和屈服点(τ0)。

为了评估触变性能，在300 s-1[τ=f(ɣ̇]期间，以0.01至300s-1的剪切速率进行CR连续扫描试验，然后再降至0.01。从该分析中，计算触变相对面积(SR)。

振荡测量

使用P35/Ti平板转子在32℃下研究黏弹性。使用注射器将约1g制剂施加到TMP35的下板。首先在1Hz的频率下进行从0.01到600Pa的振幅扫描测试，以评估线性黏弹性区(LVR)平台，屈服点(τ0，振荡模式)和流动点(τf)。之后，在LVR平台内进行了频率扫描分析。在1Hz下计算储能模量(G′)、损耗模量(G″)和损耗角正切(tan δ)。

2.2.3流变方法验证

目前的工作旨在建立一种实用且简单的方法来验证流变分析。在这种情况下，按照传统的验证程序，确定了精确度和可靠性，以及灵敏度、特异性、选择性(辨别能力)[21，29]。请注意，线性不被视为流变方法验证的相关参数，因为在流变曲线的采集中不存在固有的线性。

风险评估

根据以前的知识，可以广泛地评估可能对流变终点产生直接影响的分析条件。为了确定这些参数中哪些需要进一步研究和控制，构建了一个鱼骨图，见图1。此外，还进行了风险评估矩阵(REM)来对之前确定的分析条件进行排序，见表1 [17，30]。

图1.应用于流特征采集和验证的假想鱼骨图

表1.流变学方法验证的初始风险评估矩阵(REM)

关键: 低风险变量(L)；中等风险变量(M)；高风险变量(H)。

设备鉴定

通过确定参考标准品的黏度特征来进行流变仪鉴定。考虑了两个温度，25°C和32°C。第一个温度符合标准的规定，而第二个温度目的是为了重现之前报告中的方法条件。

为了评估方法精度，在三个不同的日期进行了三次测量。

精确度

为了测试精度，每项测试在三个不同的日期进行了十二次流变测量，以符合欧洲药品监督局的最新要求。在验证先前定义的终点时，可以接受小于15%的相对标准偏差。 [6，31]。

区分能力

验证程序中最重要的步骤之一是评估方法的鉴别能力，即方法鉴别不同配方的能力。为了解决这一问题，应证明方法的灵敏度、特异性和选择性[21，31，32]。

对F5、F10和F20的流变特性进行了交叉对比。此外，F10NC流变剖面被确定为一个额外的判别因素。通过跟踪这类制剂的流变特性，可以验证该方法的鉴别能力，因为微结构差异对辅料的浓度和生产工艺的变化高度敏感[5,21,23,33–35].在这种情况下，通过评估关键分析属性对单硬脂酸甘油酯浓度变化的响应来验证流变方法的灵敏度。如果F5测得的关键分析属性低于F10，并且F20关键分析属性平均值优于F10，则认为流变方法是敏感的。

另一方面，通过评估F5、F10和F20的关键分析属性是否能够成功地反映不同的单硬脂酸甘油酯含量来评估该方法的特异性。使用因变量为增稠剂浓度的关键分析属性的线性回归模型来估计相关系数(R2)。如果R2大于0.9，则该方法被认为是特异的[31，33，36]。方法选择性以统计方式记录。在参考配方(F10)和特别制造的配方F5、F20和F20CN之间进行成对比较。对于p < 0.05的值，平均值之间的差异被认为是显著的。如果每种制剂的关键分析属性存在显著差异，则认为该方法具有选择性。在鉴别能力研究中，每种配方有六个重复，每次流变测量都要考虑。

稳定性

为了评估方法的稳定性，评估了三种不同实验设置的影响。这些因素包括温度波动(+2°C和–2°C)、样品应用(容积式注射器与抹刀)以及最终转子的影响。对于旋转研究，C35/2 /Ti锥TMP35板(C35-P35)配置的性能与P35/Ti板-TMP35板(P35-P35)配置进行了比较。对于振荡测量，比较了P35/Ti板TMP35板(P35-P35)配置与P20/Ti板TMP20板(P20-P20)配置的影响。如果在标准方法参数设置下，关键分析属性偏离平均关键分析属性不超过15%,则该方法被认为是稳定的。

2.2.4统计分析

使用GraphPad Prism 5软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥)通过使用带有Tukey多重比较法的单因素方差分析进行统计分析。当p < 0.05时，平均值之间的差异被认为具有统计学意义。